Исследовательская работа по индивидуальному проекту из биологии показывает определение содержания пигментов в осенних листьях Девичьего винограда пятилисточкового (Parthenocissus quinquefoli) методом бумажной хроматографии. Учащаяся 10 класса рассказала об экспериментах, проведенных ею, которые позволили определить возможность протекания фотосинтеза в осенних листьях Девичьего винограда разных цветов.

В содержании индивидуального проекта об определении содержания пигментов в осенних листьях Девичьего винограда пятилисточкового (Parthenocissus quinquefoli) методом бумажной хроматографии ученица 10 класса пришла к выводу о том, что интенсивнее всего фотосинтез осенью будет у зеленых листьев, а ниже у желтых и минимальной у красных.

Оглавление

Введение

1. Обзор литературы
2. Материалы и методы исследования
3. Результаты исследований
4. Выводы

Заключение
Использованная литература

Девичий виноград пятилисточковый – это быстрорастущая лиана, которая в естественных условиях может достигать длины 20–30 метров. Молодые побеги имеют красноватый оттенок, а затем становятся темно-зелеными. Растение поднимается по гладким поверхностям, используя усики с пятью-восемью разветвлениями, которые заканчиваются липкими подушечками (присосками) диаметром 5 мм.

Листья состоят из пяти, реже трех листочков, которые имеют черешки и прикреплены к одному центральному стеблю. Кончики листочков заострены, а края имеют зубчатую форму. Сверху листья зеленые и тусклые, а снизу – синевато-зеленые и опушенные. Пластидные пигменты в зеленых растениях играют ключевую роль в фотосинтетическом процессе. Осенью листья приобретают ярко-красный и багряный оттенки на солнечной стороне, а в тени становятся светло-желтыми.
Таким образом, осенью в листьях происходит изменение набора пигментов, что можно определить с помощью хроматографии.

Актуальность проекта:
Предполагается, что методом бумажной хроматографии можно разделить различные пигменты из листьев Девичьего винограда.
Данная работа позволяет визуализировать наличие разных пигментов в составе листьев растений осенью, а конкретно - в листьях Девичьего винограда пятилисточкового (Parthenocissus quinquefoli).

Цель работы: Определить возможность протекания фотосинтеза в зеленых, желтых и красных листьях Девичьего винограда в осеннее время года.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить литературу по данной теме;
2. Освоить метод бумажной хроматографии и разделить пигменты Девичьего винограда;
3. Определить наиболее подходящий вид растворителей для выделения пигментов из листьев и бумажной хроматографии;
4. Разделить пигменты листьев Девичьего винограда методом бумажной хроматографии.

Пигменты, находящиеся в пластидах и участвующие в фотосинтезе, делятся на три класса: хлорофиллы, каротиноиды и фикобилинпротеиды. Они формируют пигментные системы в виде хромопротеидов, где пигменты связаны с белковыми комплексами. Главная функция этих пигментов — поглощение световой энергии и её преобразование в химическую. Пигменты располагаются на мембранах хлоропластов (тилакоидах), которые оптимально ориентированы для максимального поглощения света.

Хлорофиллы
Хлорофиллы поглощают красный и сине-фиолетовый свет, отражая зелёный, что придаёт растениям зелёный цвет, если он не скрыт другими пигментами. Структура хлорофиллов основана на порфириновом скелете с магнием в центре, что объясняет, почему нехватка магния ведёт к снижению уровня хлорофилла и пожелтению листьев. Молекула хлорофилла имеет гидрофобный углеводородный хвост, который «закрепляется» внутри мембран тилакоидов, а гидрофильные головы располагаются на поверхности, как солнечные батареи. Разные хлорофиллы имеют различные боковые цепи, что расширяет их спектры поглощения [1].

Каротиноиды
Каротиноиды — это жёлтые, оранжевые и красные пигменты, синтезируемые растениями и другими организмами, которые поглощают свет в сине-фиолетовой области. Они выполняют функции вспомогательных пигментов, передавая поглощённую энергию хлорофиллу и защищая его от избытка света и окисления.

Каротиноиды, часто скрытые зелёными хлорофиллами, становятся заметными осенью, когда хлорофиллы разрушаются. Они также привлекают опылителей благодаря яркой окраске цветков и плодов, например, красный цвет томатов обусловлен каротинами. Основные каротиноиды — это каротины и ксантофиллы, содержащие 40 углеродных атомов. Каротиноиды слабо связаны с белками и могут быть использованы в медицине и качестве красителей [1].

Антоцианы
Антоцианы — это растительные пигменты, обнаруживаемые как в генеративных органах растений (цветках, пыльце), так и в вегетативных (стеблях, листьях, корнях), а также в плодах и семенах. Эти соединения могут быть как постоянными компонентами клеток, так и временно появляться на определённых стадиях роста растений или в ответ на стрессовые условия. Антоцианы придают растениям красные, фиолетовые, голубые оттенки и их комбинации, окрашивая плоды, цветы и листья.

Эти пигменты представляют собой кристаллические вещества, которые хорошо растворимы в воде и щелочных растворах, но плохо растворяются в спирте и бензоле [2]. Под воздействием некоторых ферментов и разбавленных кислот антоцианы могут гидролизоваться, образуя пирилиевые соли, такие как цианидин.

Бумажная хроматография
Как известно, разделение смеси пигментов основывается на селективной абсорбции фильтровальной бумаги. Когда по бумаге под действием капиллярных сил движется раствор, молекулы его разделяются на две фазы в соответствии с их коэффициентом разделения (подвижная и неподвижная фазы) [4].
Чем больше растворимость пигмента в мобильной фазе, тем дальше он продвинется по хроматографической бумаге вместе с растворителем.

Этот вариант распределительной хроматографии чрезвычайно широко применяется для аналитических целей. Для бумажной хроматографии используют специальные сорта фильтровальной бумаги. В этом случае стационарной фаза является вода, адсорбированная бумагой, или органическая жидкость, которой пропитана бумага. Иногда бумагу модифицируют, например, обрабатывают уксусным ангидридом. При этом гидроксильные группы целлюлозы превращаются в сложноэфирные, что приводит к изменению сорбционных свойств бумаги.

Поток элюента может перемешаться вверх по полоске бумаги благодаря капиллярным силам (восходящая хроматография) или вниз самотеком (нисходящая хроматография). Зоны отдельных компонентов проявляются в виде пятен.

Объект исследования – листья Девичьего винограда разного цвета (зеленого, желтого и красного).

Предмет исследования – определение содержания пигментов в осенних листьях Девичьего винограда.

Для разделения пигментов использовалась специальная хроматографическая бумага – Ватман.
Разделение пигментов проводили методом хроматографии на бумаге по Д.И.Сапожникову [3].
Для обработки изображений хроматограмм использовалась программа InageJ v. 1.52a для получения аналоговых денситограмм и программа GetData Graph Digitizer v.2.26 для оцифровки денситограмм.

Расчет относительного содержания проводился методом трапеции (т.е. вычислялись площади трапеции между двумя каждыми последовательными точкам кривой).

Для исследования взяли 3 образца – 3 листа листа Девичьего винограда пятилисточкового, различных по внешнему виду – окраске: зеленый, красный и желтый.
Экстракция пигментов

Рисунок 1. Подготовка посуды для гомогенизации листьев и экстракции пигментов.

1. Навеску в 2 г свежего растительного материала растерли в ступке с 1-2 мл смеси ацетона со спиртом в соотношении 3:1.

Рисунок 2. Гомогенизация листьев.

2. Растертую массу количественно перенесли на стеклянный фильтр, отфильтровали на колбе Бунзена. Ступку и осадок на фильтре несколько раз промыли смесью ацетона со спиртом. Фильтрат количественно перенесли в мерную колбу на 25 мл и довести смесью растворителей, перемешали.

Рисунок 3. Выделенные из листьев пигменты, подготовленные для нанесения на хроматографическую бумагу.

Разделение пигментов
Для разделения пигментов была использована хроматографическая бумага размером 16x16 см. В нижней части бумаги, вдоль длинной стороны, следует провести стартовую линию простым карандашом, отступив 2,5 см от края. На этой линии с помощью пипетки наносятся несколько капель вытяжки, при этом необходимо одновременно подсушивать капли до тех пор, пока не образуется яркое зеленое пятно (образец №1), яркое красное пятно (образец №2) или яркое желтое пятно (образец №3).

Рисунок 4. Нанесение выделенных из листьев пигментов на хроматографическую бумагу.

Последовательно повторили действия с образцом №2 и образцом №3.
Для проведения эксперимента была собраны следующие установки (Рисунок 5). Затем бумагу, свернутую в трубку, помещают на дно цилиндрического стеклянного сосуда с притертой крышкой, в который предварительно наливают растворитель слоем 0,5 см (смесь бензола и петролейного эфира в отношении 3:1). Когда растворитель почти достигнет верха бумаги, хроматограмму доставали и высушивали в токе воздуха.

Рисунок 5. Процесс хроматографии

В литературе [3, 4] имеются данные, что на хроматограммах выше всех пигментов должен располагаться:

1. каротин - цвет ярко-желтый;

ниже каротина должны располагаться:

2. продукты распада или неполного синтеза хлорофилла - цвет серо-зеленый или бурый;
3. хлорофилл "а" - цвет сине-зеленый;
4. ксантофилл - цвет оранжевый;
5. хлорофилл "b" - цвет желто-зеленый;

Известно также, что антоцианы в выбранной системе растворителей остаются на старте и никуда не двигаются.

Рисунок 6. Разделение пигментов на хроматографической бумаге. Образец №1 (зеленый лист). Внешний вид и денситограмма.

Рисунок 7. Разделение пигментов на хроматографической бумаге. Образец №2 (красный лист). Внешний вид и денситограмма.

Рисунок 8. Разделение пигментов на хроматографической бумаге. Образец №3 (желтый лист). Внешний вид и денситограмма.

Анализ разделения пигментов
Для обработки изображений использовалась программа InageJ v. 1.52a для получения денситограмм и программа GetData Graph Digitizer v.2.26 для оцифровки денситограмм. После оцифровки данные переносились в программу MS Excel для расчета содержания веществ в процентах, расчета Rf и идентификации веществ.

Как видно на приведенных рисунках – фотографиях хроматограмм и их денситограммах, в Образце №1 (зеленый лист) были идентифицированы следующие пигменты (снизу-вверх, по мере роста относительной подвижности Rf) (Таблица 1).

Таблица 1. Анализ денситограммы образца №1.

№	Rf	Идентификация	Содержание, %
1	0,00	Антоцианы	5
2	0,21	Ксантофилл	33
3	0,40	Хлорофилл в	30
4	0,65	Хлорофилл а	18
5	0,76	Каротин	13
6	0,95	Продукты распада хлорофилла	2

Как видно из расшифровки денситограммы в ходе исследовательской работы, в зеленых листьях присутствует весь набор пигментов и, в дополнение к ним, антоцианы. В самом большом количестве содержатся ксантофилл (33%) и хлорофилл в (30%). Антоцианов содержится всего 5%, а продуктов распада хлорофилла всего 2%.
В Образце №2 (красный лист) были идентифицированы следующие пигменты (снизу-вверх, по мере роста относительной подвижности Rf) (Таблица 2).

В красных листьях обнаружены в больших количествах только антоцианы (25%), которые и придают листьям красный цвет, и очень много продуктов распада хлорофилла (75%).

Таблица 2. Анализ денситограммы образца №2.

№	Rf	Идентификация	Содержание, %
1	0,00	Антоцианы	25
2	0,93	Продукты распада хлорофилла	75

В Образце №3 (желтый лист) были идентифицированы следующие пигменты (снизу-вверх, по мере роста относительной подвижности Rf) (Таблица 3).

Таблица 3. Анализ денситограммы образца №3.

№	Rf	Идентификация	Содержание, %
1	0,00	Антоцианы	11
2	0,23	Ксантофилл	56
3	0,42	Хлорофилл в	18
4	0,95	Продукты распада хлорофилла	14

В желтых листьях антоцианы содержатся в промежуточных количествах между красными и зелеными (11%), в больших количествах содержится ксантофилл (56%). Остатков хлорофилла в (18%) и продуктов распада хлорофилла (14%) в желтых листьях содержатся примерно равные доли.

На основании анализа содержания пигментов в растительных листьях можно сделать вывод о составе веществ, окрашивающих их, а также о вероятной интенсивности фотосинтеза в зависимости от цвета листьев.

Состав веществ:
Зеленый лист (Образец №1): В этом образце присутствуют все основные пигменты, способствующие фотосинтезу, такие как хлорофиллы (а и b), ксантофилл и каротин. Хлорофилл а и b (в сумме 48%) являются наиболее важными для фотосинтетического процесса. Кроме того, присутствуют антоцианы и продукты распада хлорофилла, но в незначительных количествах.

Красный лист (Образец №2): Здесь основными пигментами являются антоцианы (25%) и продукты распада хлорофилла (75%). Хлорофиллы практически отсутствуют, что указывает на низкую способность к фотосинтезу в данной стадии.

Желтый лист (Образец №3): В желтых листьях преобладает ксантофилл (56%), а также присутствуют антоцианы (11%) и остатки хлорофилла (18%). Продукты распада хлорофилла составляют 14%. Хотя желтые листья содержат меньше хлорофилла, чем зеленые, наличие ксантофилла может частично компенсировать это.

В процессе индивидуального проекта на тему «Определение содержания пигментов в осенних листьях Девичьего винограда пятилисточкового методом бумажной хроматографии» для достижения цели мною был освоен метод хроматографии и проведен анализ содержания пигментов в листьях винограда, а также определена возможность протекания фотосинтеза в зеленых, желтых, красных листьях Девичьего винограда в осеннее время года.

В результате моей исследовательской работы было показало, что зеленые листья, благодаря высокому содержанию хлорофиллов, обладают наибольшей способностью к фотосинтезу. Хлорофиллы эффективно поглощают свет, что способствует максимальной продуктивности фотосинтетических процессов.

Красные листья, из-за значительного преобладания антоцианов и отсутствия хлорофиллов, имеют минимальную способность к фотосинтезу. Высокое содержание продуктов распада хлорофилла также указывает на завершение фотосинтетической активности в этих листья.

Желтые листья имеют умеренную способность к фотосинтезу благодаря наличию ксантофилла и остаткам хлорофилла. Однако их фотосинтетическая активность будет значительно ниже, чем у зеленых листьев, но выше, чем у красных.

Таким образом, интенсивность фотосинтеза осенью будет наивысшей у зеленых листьев, ниже у желтых и минимальной у красных.
Изучение данного метода хроматографии в рамках проекта позволит мне и моим сверстникам разобраться в вопросах применения биологических знаний в практических ситуациях при сдаче ЕГЭ по биологии.

1. Джафарова Э. Э., Мустафаева Л. А., Серкеров С. В. Состав и содержание антоцианов цветков Polygonum aviculare L //Химия растительного сырья. – 2016. – №. 2. – С. 103-107.
2. Желнин Ю.Ю., Лихопуд Э.В. Пигменты листа. Их свойства и значение // Биология в школе. – 2006. – № 4. – С. 42-43.
3. Пигменты пластид зеленых растений и методика их исследования /Под ред. Д. И. Сапожникова. — М.; Л., 1964.
4. Современные методы биофизических исследований: Практикум по биофизике / Под ред. А. Б. Рубина. — М.: Высшая школа, 1988.